Uji Kualitatif Protein dan Asam Amino

Asam amino merupakan unit pembangun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida pada setiap ujungnya. Protein tersusun dari atom C, H, O, dan N, serta kadang-kadang P dan S. Dari keseluruhan asam amino yang terdapat di alam hanya 20 asam amino yang yang biasa dijumpai pada protein.

Gambar 1. Struktur molekul asam amino

Dari struktur umumnya, asam amino mempunyai dua gugus pada tiap molekulnya, yaitu gugus amino dan gugus karboksil, yang digambarkan sebagai struktur ion dipolar. Gugus amino dan gugus karboksil pada asam amino menunjukkan sifat-sifat spesifiknya. Karena asam amino mengandung kedua gugus tersebut, senyawa ini akan memberikan reaksi kimia yang yang mencirikan gugus-gugusnya. Sebagai contoh adalah reaksi asetilasi dan esterifikasi. Asam amino juga bersifat amfoter, yaitu dapat bersifat sebagai asam dan memberikan proton kepada basa kuat, atau dapat bersifat sebagai basa dan menerima proton dari basa kuat.

Semua asam amino yang ditemukan pada protein mempunyai ciri yang sama, gugus karboksil dan amino diikat pada atom karbon yang sama. Masing-masing berbeda satu dengan yang lain pada gugus R-nya, yang bervariasi dalam struktur, ukuran, muatan listrik, dan kelarutan dalam air. Beberapa asam amino mempunyai reaksi yang spesifik yang melibatkan gugus R-nya.

Melalui reaksi hidrolisis protein telah didapatkan 20 macam asam amino yang dibagi berdasarkan gugus R-nya, berikut dijabarkan penggolongan tersebut : asam amino non-polar dengan gugus R yang hidrofobik, antara lain Alanin, Valin, Leusin, Isoleusin, Prolin, Fenilalanin, Triptofan dan Metionin. Golongan kedua yaitu asam amino polar tanpa muatan pada gugus R yang beranggotakan Lisin, Serin, Treonin, Sistein, Tirosin, Asparagin dan Glutamin. Golongan ketiga yaitu asam amino yang bermuatan positif pada gugus R dan golongan keempat yaitu asam amino yang bermuatan negatif pada gugus R. Dari ke-20 asam amino yang ada, dijumpai delapan macam asam amino esensial yaitu valin, leusin, Isoleusin, metionin, Fenilalanin, Triptofan, Treonin, dan Lisin. Asam amino essensial ini tidak bisa disintesis sendiri oleh tubuh manusia sehingga harus didapatkan dari luar seperti makanan dan zat nutrisi lainnya.

Tujuan Percobaan

Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari beberapa reaksi uji terhadap asam amino dan protein.

Bahan dan Alat

Alat-alat yang digunakan adalah tabung reaksi, gelas piala, pipet tetes, pipet Mohr, kertas saring, corong, dan penangas air. Sementara bahan-bahan yang digunakan adalah albumin, gelatin, kasain, pepton, fenol, pereaksi millon, pereaksi Hopkins cole, pereaksi biuret, ninhidrin, H2SO4, NaOH, HNO3, CuSO4, HgCl2, AgNO3, (NH4)2SO4, HCl, Pb-asetat, etanol, asam asetat, dan buffer asetat pH 4,7.

Prosedur Percobaan

Uji Millon. Sebanyak 5 tetes pereaksi Millon ditambahkan ke dalam 3 mL larutan protein, dipanaskan. Uji dilakukan terhadap larutan albumin 2%, gelatin 2%, kasein 2%, pepton 2%, dan fenol 2%.

Uji Hopkins-Cole. Sebanyak 2 mL larutan protein dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole dalam tabung reaksi. Ditambahkan 3 mL H2SO4 pekat melalui dinding tabung sehingga membentuk lapisan dari cairan. Didiamkan, setelah beberapa detik akan terbentuk cincin violet (ungu) pada pertemuan kedua lapisan cairan, apabila positif mengandung triptofan. Uji dilakukan terhadap larutan albumin 2%, gelatin 2%, kasein 2%, dan pepton 2%.

Uji Ninhidrin. Sebanyak 0.5 mL larutan ninhidrin 0.1% ditambahkan ke dalam 3 mL larutan protein. Dipanaskan selama 10 menit, diamati perubahan warna yang terjadi. Uji dilakukan terhadap larutan albumin 0.02%, gelatin 0.02%, kasein 0.02%, dan pepton 0.02%.

Uji belerang. Sebanyak 2 mL larutan protein ditambah 5 mL NaOH 10%, dipanaskan selama 5 menit. Kemudian ditambah 2 tetes larutan Pb-asetat 5%, pemanasan dilanjutkan, diamati warna yang terjadi. Uji dilakukan terhadap larutan albumin 0.02%, gelatin 0.02%, kasein 0.02%, dan pepton 0.02%.

Uji Xanthoproteat. Sebanyak 2 mL larutan protein ditambahkan 1 mL HNO3 pekat, dicampur, kemudian dipanaskan, diamati timbulnya warna kuning tua. Didinginkan, ditambahkan tetes demi tetes larutan NaOH pekat sampai larutan menjadi basa. Diamati perubahan yang terjadi. Uji dilakukan terhadap larutan albumin 2%, gelatin 2%, kasein 2%, pepton 2%, dan fenol 2%.

Uji Biuret. Sebanyak 3 mL larutan protein ditambah 1 mL NaOH 10% dan dikocok. Ditambahkan 1-3 tetes larutan CuSO4 0.1%. Diamati timbulnya warna.

Pada pengendapan protein oleh logam, oleh garam, oleh alkohol, uji koagulasi dan denaturasi protein. Kedalam 3 ml albumin ditambahkan 5 tetes larutan HgCl2 2%, percobaan diulangi dengan larutan Pb-asetat 5%, dan AgNO3 5%. Sepuluh ml larutan protein dijenuhkan dengan amonium sulfat yang ditambahkan sedikit demi sedikit, kemudian diaduk hingga mencapai titik jenuh dan disaring. Lalu diuji kelarutannnya dengan ditambahkan air, untuk endapan diuji dengan pereaksi Millon dan filtrat dengan pereaksi biuret. Ditambahkan 2 tetes asam asetat 1 M ke dalam tabung yang berisi 5 ml larutan protein, kemudian tabung tersebut diletakkan dalam air mendidih selama 5 menit. Lalu diambil endapan dengan batang pengaduk, untuk endapan diuji kelarutannya dengan air , sementara endapan dengan pereaksi Millon. Disiapkan 3 tabung reaksi, tabung pertama diisi campuran sebagai berikut ; 5 ml larutan albumin, 1 ml HCl 0,1 M dan 6 ml etanol 95%. Ke dalam tabung kedua dimasukkan5 ml larutan albumin, 1 ml NaOH 0,1 M dan 6 ml etanol 95%. Ke dalam tabung ketiga 5 ml larutan albumin, 1 ml buffer asetat ph 4,7 dan 6 ml etanol 95%.

Pada percobaan denaturasi protein siapkan 3 tabung reaksi, tabung reaksi pertama diisi 9 ml larutan albumin dan 1ml HCl 0,1 M, tabung reaksi kedua 9 ml larutan albumin dan 1 ml NaOH 0,1 M dan kedalam tabung reaksi ketiga ditambahkan hanya 1 ml buffer asetat pH 4,7.

Data dan Hasil Pengamatan

Tabel 1. berbagai uji kualitatif pada beberapa larutan protein

Keterangan:
(-) = uji negatif
(+) = uji positf (Millon: larutan berwarna merah, terbentuk garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi; Hopkins-Cole: terbentuk cincin violet, adanya triptofan; Ninhidrin: terbentuk warna biru, khusus untuk prolin dan hidroksiprolin berwarna kuning; Belerang: terbentuk garam PbS berwarna hitam; Xanthoproteat: terbentuk warna kuning tua, adanya gugus benzena; dan Biuret: terbentuk warna violet).

Tabel 2. Pengaruh penambahan logam berat pada albumin

Keterangan: (+) = terbentuk endapan

Tabel 3. Pengendapan protein oleh garam (NH4)2SO4

Tabel 4. Uji Koagulasi pada protein

Tabel 5. Pengendapan protein oleh alkohol

Keterangan:

• tabung I berisi 5 ml albumin, 1 ml HCl 0,1 M dan 6 ml etanol 95 %
• tabung II berisi 5 ml albumin, 1 ml NaOH 0,1 M dan 6 ml etanol 95%
• tabung III berisi 5 ml albumin, 1 ml buffer asetat pH 4,7 dan 6 ml etanol 95%
• (+): Terbentuk endapan
• (-): Tidak terbentuk endapan

Tabel 6. Denaturasi protein oleh penambahan berbagai senyawa

Keterangan:

• tabung I berisi 9 ml albumin, 1 ml HCl 0,1 M
• tabung II berisi 9 ml albumin, 1 ml NaOH 0,1 M
• tabung III berisi 1 ml buffer asetat pH 4,7
• (+): Terbentuk endapan
• (-): Tidak terbentuk endapan

Pembahasan

Pada berbagai uji kualitatif yang dilakukan terhadap beberapa macam protein, semuanya mengacu pada reaksi yang terjadi antara pereaksi dan komponen protein, yaitu asam amino tentunya. Beberapa asam amino mempunyai reaksi yang spesifik pada gugus R-nya, sehingga dari reaksi tersebut dapat diketahui komponen asam amino suatu protein.

Prinsip dari uji millon adalah pembentukan garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi. Tirosin merupakan asam amino yang mempunyai molekul fenol pada gugus R-nya, yang akan membentuk garam merkuri dengan pereaksi millon. Dari hasil percobaan, diketahui bahwa protein albumin dan kasein mengandung Tirosin sebagai salah asam amino penyusunnya, sedangkan gelatin dan pepton tidak. Fenol dalam hal ini digunakan sebagai bahan percobaan karena Tirosin memiliki molekul fenol pada gugus R-nya. Di sini, uji terhadap fenol negatif, walaupun secara teori tidak. Alasan yang mungkin untuk hal ini adalah kesalahan praktikan dalam bekerja.

Pada uji Hopkins cole, uji positif ditunjukkan oleh albumin, gelatin, kasein, dan pepton, dengan ditunjukkan oleh adanya cincin berwarna ungu. Uji ini spesifik untuk protein yang mengandung Triptofan. Triptofan akan berkondensasi dengan aldehid bila ada asam kuaat sehngga membentuk cincin berwarna ungu.

Protein yang mengandng sedikitnya satu gugus karboksil dan gugus asam amino bebas akan bereaksi dengan ninhidrin membentuk persenyawaan berwarna. Uji ini bersifat umum untuk semua asam amino, dan menjadi dasar penentuan kuantitatif asam amino. Pada uji ini, hanya kasein yang menunjukkan uji negatif terhadap ninhidrin. Hal ini disebabkan karena pada kasein tidak mengandung sedikitnya satu gugus karboksil dan amino yang terbuka.

Sistein dan Metionin merupakan asam amino yang mengandung atom S pada molekulnya.. Reaksi Pb-asetat dengan asam-asam amino tersebut akan membentuk endapan berwarna kelabu, yaitu garam PbS. Penambahan NaOH dalam hal ini adalah untuk mendenaturasikan protein sehingga ikatan yang menghubungkan atom S dapat terputus oleh Pb-asetat membentuk PbS. Dari semua bahan yang diuji, hanya albumin yang membentuk endapan PbS, sehingga dapat disimpulkan albumin mengandung Sistein ataupun Metionin.

Inti benzena dapat ternitrasi oleh asam nitrat pekat menghasilkan turunan nitrobenzena. Fenilalanin, Tirosin, dan Triptofan yang mengandung inti benzena pada molekulnya juga mengalami reaksi dengan HNO3 pekat. Untuk perbandingan, dapat ditunjukkan oleh fenol yang bereaksi membentuk nitrobenzena. Hasil uji menunjukkan bahwa dari semua bahan, hanya kasein yang tidak mengandung asam amino yang mempunyai inti benzena pada molekulnya. Tetapi hal ini patut dipertanyakan, karena dari data-data yang diperoleh pada uji millon dan uji Hopkins cole, kasein mengandung tirosin dan triptofan. Salah satu alasan yang mungkin adalah karena kesalahan kerja praktikan dalam mengamati warna yang terbentuk selama reaksi.

Pada uji biuret, semua protein yang diujikan memberikan hasil positif. Biuret bereaksi dengan membentuk senyawa kompleks Cu dengan gugus -CO dan -NH pada asam amino dalam protein. Fenol tidak bereaksi dengan biuret karena tidak mempunyai gugus -CO dan -NH pada molekulnya.

Protein yang tercampur oleh senyawa logam berat akan terdenaturasi. Hal ini terjadi pada albumin yang terkoagulasi setelah ditambahkan AgNO3 dan Pb-asetat. Senyawa-senyawa logam tersebut akan memutuskan jembatan garam dan berikatan dengan protein membentuk endapan logam proteinat. Protein juga mengendap bila terdapat garam-garam anorganik dengan konsentrasi yang tinggi dalam larutan protein. Berbeda dengan logam berat, garam-garam anorganik mengendapkan protein karena kemampuan ion garam terhidrasi sehingga berkompetisi dengan protein untuk mengikat air. Pada percobaan, endapan yang direaksikan dengan pereaksi millon memberikan warna merah muda, dan filtrat yang direaksikan dengan biuret berwarna biru muda. Hal ini berarti ada sebagian protein yang mengendap setelah ditambahkan garam.

Pada uji koagulasi, endapan albumin yang terjadi setelah penambahan asam asetat, bila direaksikan dengan pereaksi millon memberikan hasil positif. Hal ini menunjukkan bahwa endapan tersebut masih bersifat sebagai protein, hanya saja telah terjadi perrubahan struktur tersier ataupun kwartener, sehingga protein tersebut mengendap. Perubahan struktur tesier albumin ini tidak dapat diubah kembali ke bentuk semula, ini bisa dilihat dari tidak larutnya endapan albumin itu dalam air.

Pada uji pengendapan oleh alkohol, hanya tabung-tabung yang mengandung asam (ber-pH rendah) yang menunjukkan pengendapan protein. Pada protein, ujung C asam amino yang terbuka dapat bereaksi dengan alkohol dalam suasana asam membentuk senyawa protein ester. Pembentukan ester ini ditunjukkan oleh adanya endapan yang terbentuk.
Protein akan terdenaturasi atau mengendap bila berada pada titik isolistriknya, yaitu pH dimana jumlah muatan positif sama dengan jumlah muatan negatifnya. Pada uji denaturasi, protein yang dilarutkan dalam buffer asetat pH 4,7 menunjukkan adanya endapan. Protein yang dilarutkan dalam HCl maupun NaOH, keduanya tidak menunjukkan adanya pengendapan, namun setelah ditambahkan buffer asetat dengan volume berlebih, protein pun mengendap hal ini menunjukkan bahwa protein albumin mengendap pada titik isolistriknya, yaitu sekitar pH 4,7.

Kesimpulan

Protein dan asam amino memberikan reaksi yang bersifat khas, bukan hanya bagi gugus amino dan gugus karboksil bebas, tetapi juga bagi gugus R yang terkandung di dalamnya. Protein dapat bereaksi dengan pereaksi-pereaksi lain seperti juga asam amino yang menjadi penyusunnya. Protein dapat mengendap atau terdenaturasi oleh logam berat, garam-garam anorganik, rusaknya struktur tersier dan kwartener, serta karena berada pada titik isolistriknya.

Daftar Pustaka

Girindra, A. 1986. Biokimia I. Gramedia, Jakarta.
Lehninger, A. 1988. Dasar-dasar Biokimia. Terjemahan Maggy Thenawidjaya. Erlangga, Jakarta

Artikel yang berhubungan:

1. Karbohidrat pada Uji Kualitatif
2. Uji Lipid